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In vitro 3T3 NRU 광독성시험을 이용한 자외선 차단 원료의 광독성 여부 평가
Evaluation of UV Filters in a Sunscreen for Phototoxicity Using In Vitro 3T3 Neutral Red Uptake (NRU) Phototoxicity Test
최지예 ( Ji Yei Choi ) , 조선아 ( Sun A Cho ) , 김지훈 ( Ji Hoon Kim ) , 이존환 ( John Hwan Lee ) , 신계호 ( Kye Ho Shin )
UCI I410-ECN-0102-2014-300-002085656

UV에 의한 피부 손상은 free radical을 생성하여 세포막 등의 손상을 초래하는 산소 의존적인 반응과 photo-products를 형성하여 핵이나 세포막을 손상시키는 산소 비의존적 반응으로 구분된다 (Gaspar et al., 2007). 일반적으로 화학적 자외선 차단제는 피부에 침투가 가능하며, 자외선영역의 에너지를 흡수하여 흥분상태가 되었다가 기저상태로 돌아오면서 에너지를 방출하여 세포를 손상시킨다 (Gaspara et al., 2013). 가장 일반적으로 사용되는 유기 자외선 차단제 중 하나인 Avobenzone은 UV에 노출되었을 때, 반응성이 매우 높아져서 singlet excited state가 될 수 있는 에너지를 제공하여 활성산소종을 생성한다 (Chatelain et al., 2010). 또한 유기 원료인 octocrylene, octylmethoxycinnamate, benzophenone-3, para-aminobenzoic acid (PABA), 2-phenylbenzimidazle-5-sulfonic acid (PBSA)가 포함된 자외선 차단제를 발랐을 때, 표피를 침투하여 nucleated layer 에 도달할 수 있으며 활성산소종을 생성한다고 보고되었다 (Hanson et al., 2006). 형성된 활성산소종은 DNA는 물론 세포막의 지질을 손상시켜 세포의 apoptosis와도 관련있으며 (Hensley et al., 2000), 피부암과 건선에도 영향을 미치는 것으로 보고되었다 (Trouba et al., 2002). 물리적 자외선 차단 성분은 피부에 투과되지 않기 때문에 화학적 자외선 차단 성분보다 상대적으로 안전하다고 알려져 있다. 그러나 물리적 자외선 차단제의 나노입자의 사용이 증가하고 있어서 피부 투과에 대한 부분은 논란이 되고 있다. 나노입자는 잠재적으로 폐나 혈류를 통하여 내부 장기에 손상을 줄 수 있기 때문에 독성학적인 측면에서도 이슈가 되고 있다 (Shi et al., 2013). 특히 Titanium dioxide의 경우 빛에 의해 활성화되어 광촉 매작용을 하며, 피부 세포와 반응하여 singlet oxygen, superoxide anions (O2-), hydroxyl radicals (OH-)와 같은 활성산소종을 생성하여 세포와 미토콘드리아 손상에 의해 독성을 나타낸다 (Yin et al., 2012). 그러나 이러한 독성은 광활성을 줄여주는 화학물질로 코팅했을 경우 크게 감소하여 태양광에 노출되어도 입자가 안정하게 유지되도록 한다 (Tang et al., 2013). 따라서 현재 자사에서는 코팅된 무기 원료를 사용하며, 유기 원료는 10% 이내, 무기 원료는 25% 이내 사용함으로써 보다 안전한 제품을 만들고 있다. 자외선 차단제 원료의 광독성에 대한 안전성 평가는 필수적이고, 그 동안은 동물 실험으로 안전성을 평가 하였으나 새로운 in vitro 평가 프로세스가 필요하다. 따라서 본 연구에서 OECD에서 이미 인증한 in vitro 3T3 NRU 광독성 시험법을 이용하여 자외선 차단제의 광독성 판정 가능성을 확인하고자 하였다. 첫번째 실험에서는 주로 사용되는 자외선 차단 원료 (유기 자외선 차단 원료 8종, 무기 자외선 차단 원료 11종) 19종을 1,000 ㎍/㎖ 의 농도부터 serial dilution하였으며, 유기 자외선 차단 원료 1종, 무기 자외선 차단 원료 1종이 광독성 의심으로 판정되고 유기 자외선 차단 원료 1종이 광독성 양성으로 판정되었다. in vitro 3T3 NRU 광독성 시험법에서는 처리시 배지의 투명도를 유지하는 물질을 실험 시료로 권장하고 있으나, 자외선 차단 원료의 경우 대부분 배지에 대한 용해도가 낮아 불투명하게 변하였으며 불균일한 분산 형태로 존재하는 것이 많았다. 또한 용해되지 않고 분산되어 있던 입자들은 처리 시간 동안 가라앉아 plate의 바닥에 붙어있는 마우스 섬유모세포에 부착되어 세척이 잘 되지 않았다. OECD guideline 에는 시험 용액의 불투명성과 침전 등이 발생하지 않아야 한다고 제시되어있으며 (OECD, 2004), 위양성이 고려되어(Spielmann et al., 2000), 이러한 문제점을 줄이고자 최고 농도를 100 ㎍/㎖ 로 낮추어 재검정 한 결과(Yin et al., 2012), 광독성 의심 또는 양성으로 판정 되었던 4종의 원료 모두 광독성 음성으로 판정되었다. 이 원료 4종의 기존의 in vivo 연구에서 광독성이 없다고 보고된 바 있으므로 첫번째 실험의 결과는 자외선 차단 원료의 난용성에 의해 위양성으로 판정되었다고 추정된다. 최근 연구에서 나노입자의 in vitro 실험을 이용한 연구에서는 TiO2를 2시간 정도 초음파 처리하고 처리 직전까지 약 10분간 믹싱함으로써 세포에 점착되는 현상을 줄일 수 있다고 보고되었다(Tang et al., 2013). 자외선 차단 원료는 매일 반복적으로 노출되고, UV에 대한 방어 작용을 통하여 피부를 보호하는 기능을 하므로 광독성 평가법이 필수적이나, 기존의 in vitro 3T3 NRU 광독성 시험법을 자외선 차단 원료의 평가에 그대로 적용하는 데에는 여러 가지 한계점이 있었다. 보다 정확한 측정을 위해서는 시험물질의 용해도 개선 및 세포 생존율 평가에 간섭을 주는 현상에 대한 개선이 필요하며, 원료뿐만 아니라 제형에 따른 변화 혹은 제품 내에서 원료의 조합에 따른 광독성 발생 여부에 대하여 추가적인 연구가 필요하다.

It is well known that sunscreens protect from skin damage induced by UV. To maintain protective effect of UV filter, it`s important to keep photostability and photo-safety. According to the ban of animal test in cosmetics and its ingredients, it needs to develop the evaluating of UV filter for phototoxicity. The aim of this study was to evaluate the applicability of in vitro 3T3 NRU phototoxicity test instead of animal experiments as an alternative method. Commercially used 19 sunscreen ingredients (8 organic UV filters (O1-8), 11 mineral UV filters (M1-11)) were tested. There was no phototoxicity, in case of concentration below 1,000 ㎍/㎖, however, above 1,000 ㎍/㎖, two UV filters showed phototoxicity. It was estimated that the false positive took place based on existing in vivo data owing to insolubility and adhesive characteristics of ingredients. Improvements such as adjustment of concentration or ultra-sonication of chemicals are needed to apply in vitro 3T3 NRU phototoxicity test for UV filters.

[자료제공 : 네이버학술정보]
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