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한국미생물·생명공학회지검색

Microbiology and Biotechnology Letters


  • - 주제 : 자연과학분야 > 생물
  • - 성격 : 학술지
  • - 간기: 계간
  • - 국내 등재 : KCI 등재
  • - 해외 등재 : - / SCOPUS
  • - ISSN : 1598-642x
  • - 간행물명 변경 사항 : 산업미생물학회지(~2001)→한국미생물·생명공학회지(2002~)
논문제목
수록 범위 : 36권 3호 (2008)

생물의약품 제조공정에서 Bovine Parvovirus 정량 검출을 위한 Real-Time PCR

이동혁 ( Dong Hyuck Lee ) , 이정희 ( Jung Hee Lee ) , 김찬경 ( Chan Kyong Kim ) , 김태은 ( Tae Eun Kim ) , 배정은 ( Jung Eun Bae ) , 김인섭 ( In Seop Kim )
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소의 혈액, 세포, 조직, 기관 등은 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 원료로 널리 사용되고 있다. 소유래 물질을 원료로 사용한 제제의 경우 소유래 원료 물질에 다양한 바이러스가 오염된 사례가 있기 때문에 바이러스 안전성 검증이 필수적이다. BPV는 소에게 가장 흔하게 감염되는 바이러스 중의 하나이다. 소유래 물질을 원료로 하는 생물의 약품, 조직공학제제, 세포치료제 등에서 BPV 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BPV real-time PCR 시험법을 확립하였다. BPV에 특이적인 primer를 선별하였으며, 형광염료 SYBR Green I을 사용하여 BPV DNA 정량 검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 real-time PCR 민감도는 1.3 × 10-1 TCID50/mL이었다. 확립된 시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 시험법 검증을 실시한 결과 특이성(specificity)과 재현성(reproducibility)이 우수함을 확인하였다. 확립된 real-time PCR을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 CHO 세포주와 소유래 콜라겐에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. BPV를 감염시킨 CHO 세포에서 세포변병효과를 관찰할 수 없었지만, 세포와 세포배양 상청액에서 BPV를 정량적으로 검출할 수 있었다. 소유래 콜라겐에서도 1.3 × 100 TCID50/mL까지 정량적으로 검출할 수 있었다.

Thermus thermophilus HJ6 유래 내열성 Trehalose Synthase의 유전자 클로닝 및 발현

김현정 ( Hyun Jung Kim ) , 김한우 ( Han Woo Kim ) , 전숭종 ( Sung Jong Jeon )
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내열성 Trehalose synthase를 생산하는 초고온성 균주 HJ6은 일본 Arima 온천수에서 분리하였다. 세포의 길이는 2~4um, 직경 0.4 um의 간균으로 생육최적 pH와 온도는 각각 6.5와 80℃이였다. 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석하고 계통학적으로 분류한 결과, HJ6 균주는 Thermus thermophilus에 속하는 것으로 동정되었다. PCR법을 이용하여 trehalose synthase(TS) 유전자를 클로닝하고 염기서열을 분석한 결과, ORF는 2,898개의 뉴클레오타이드로 구성되고 975개의 아미노산을 암호화하였다. 아마노산 서열을 바탕으로 상동성을 분석한 결과, Thermus caldophilus GK24 유래TS와 99%, Meiothermus ruber 유래 TS와 83%의 identity를 나타내었다. 이 유전자를 온도감수성 프로모터를 포함하는 pJLA503 벡터를 이용하여 대장균에서 발현하고 정제하여 약 110 kDa의 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 효소는 트레할로스 전환활성에 대한 최적 pH가 7.5이고, 최적온도는 80℃이며, 활성의 반감기는 90℃에서 40분으로 확인되어 높은 내열성을 가지는 것으로 확인되었다. 본 효소의 트레할로스 최대 전환율은 기질농도 500 mM에서 55.7%를 나타내었고, 기질 농도가 증가함에 따라 더불어 증가하였기 때문에 본 효소의 트레할로스 전환율은 기질농도에 의존적인 것으로 생각되었다.

사상성 진균 Aspergillus nidulans의 Phospholipase B 유전자(plb A)의 클로닝

홍사현 ( Sa Hyun Hong ) , 조은민 ( Eun Min Cho ) , 송승은 ( Seung Eun Song ) , 엄치용 ( Chi Yong Eom )
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Phospholipase B(PLB) families는 phospholipase(PL), lysophospholipase(LPL) 그리고 lysophospholipasetransacylase(LPTA) 의 활성을 공유하고 있는 효소이다. 본 연구에서는, 사상성 진균인Aspergillus nidulans에서 최초로 lipase motifs를 보유하고 있는 단백질 Phospholipase B를 인코딩하는 유전자(plb A)를 클로닝하였다. plb A는 다양한 PLB효소들의 lipase 보존영역들의 염기서열 정보에 근거하여 제작한 probe를 이용하여 A. nidulans genomic DNA library로 부터 분리하였다. Phospholipase B 유전자의 염기서열을 결정한 결과 626아미노산으로 구성된 단백질을 코드하고 있었다. PlbA는 Penicillium notatum의 PLB와는 72%의 높은 상동성을 나타내었으나, 다른 생물유래의 PLA와는 낮은 상동성을 나타내었다.

호이초(Saxifraga stolonifera) 지상부의 항균, 항혈전 및 항산화 활성 평가

손호용 ( Ho Yong Sohn ) , 류희영 ( Hee Young Ryu ) , 장유진 ( Yu Jin Jang ) , 장한수 ( Han Su Jang ) , 박유미 ( Yu Mi Park ) , 김사열 ( Sa Youl Kim )
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호이초는 한국, 일본, 중국 및 러시아에서 자생하는 범의 귀과의 다년생풀로, 민간에서는 주로 폐렴, 동상, 피부 염증 및 미생물감염 치료에 사용하여 왔다. 국내에서는 주로 관상용으로 재배되고 있어, 현재까지 재배관련 연구를 제외하고 생리활성 및 성분에 대한 연구는 전무한 상태이다. 본 연구에서는 호이초의 생리활성 평가를 위해 호이초 지상부의 생즙 및 메탄올 추출물을 조제하여 각각 항균, 항혈전 및 항산화 활성을 평가하였다. 지상부 생즙의 경우 Proteus vulgaris, Escherichia coli O157:H7 및 Candida albicans에 대해 항균효과가 인정되었고, 항산화 활성은 미약하였다. 반면 메탄올 추출물의 경우 염증 피부에서 분리한 세균, 일부세균 및 C. albicans에 대해 항균력을 나타내었으며, 강력한 항산화 활성을 나타내었다(IC50=37.5 ug/mL). 생즙 및 추출물 모두 1.5 mg/mL 농도에서 항혈전 활성은 나타나지 않았다. 메탄올 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 항산화 활성 평가 결과, ethylacetate 및 butanol 분획에서 6.9 및 7.8 ?g/mL의 IC50를 나타내어, vitamin C 및 BHT에 필적할 만한 강력한 항산화 활성을 확인하였다. 각 시료의 성분 분석 결과, 각 분획의 항산화 활성물질은 다양하며, ethylacetate 분획의 경우 항산화물질은 폴리페놀 배당체로 추측된다. 본 연구결과는 국내 자생 호이초가 항산화 식물자원으로 유용하게 개발될 수 있음을 제시하고 있다.

장수상황버섯 균사체를 이용한 한약재의 고체발효 및 메탄올 추출물의 트롬빈 저해 활성과 항산화 활성

신용규 ( Yong Kyu Shin ) , 장한수 ( Han Su Jang ) , 김종식 ( Jong Sik Kim ) , 류희영 ( Hee Young Ryu ) , 김종국 ( Jong Kuk Kim ) , 권인숙 ( In Sook Kwun ) , 손호용 ( Ho Yong Sohn )
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장수상황버섯(Phellinus baumii) 균사체를 이용한 한약재의 고체발효를 통한 기능성 강화 한약재 생산을 목적으로, 항산화 활성 또는 혈류 개선활성이 우수하다고 알려진 36종의 한약재를 멸균 후, 장수상황버섯 균사체를 접종하여 고체발효 가능성을 검토하였다. 25℃, 상대습도 90% 배양기에서 20일간 발효시킨 결과, 감국, 대추, 백부자, 신이 및 황정을 제외한 31종에서 양호한 발효가 진행되었으며, 발효 가능여부는 한약재 식물체의 사용부위의 구조적 견고성, 영양조건 및 항진균 활성 등과 연관되리라 판단된다. 한약재의 고체발효 이후, 발효전과 비교하였을 때 평균 수분함량은 30.84±15.67%에서 67.21±11.43%로 2.2배 증대되었으며, 평균 메탄올 추출효율과 평균 pH는 13.91±12.22% 및 5.06±0.87에서 각각 11.16±7.06% 및 4.83±0.73으로 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 각각의 메탄올 추출물을 이용한 항혈전 활성 및 항산화 활성을 측정한 결과, 골쇄보, 천련자, 도엽, 와송의 경우에는 트롬빈 저해 활성이 각각 발효전에 비하여 31.38, 23.63, 22.57, 13.85% 증가되었으며, 원지, 현삼, 백지, 향부자, 골쇄보 및 육종용에서는 DPPH 소거능이 발효전에 비해 각각 58.9, 49.8, 48.1, 32.8, 24.1, 20.7% 증가되어 장수상황버섯 균사체 발효 한약재의 긍정적 생리활성 증가를 확인하였다. 본 연구결과는 상황버섯 균사체를 이용한 한약재의 고체발효를 통해, 특정 기능성의 강화 원재료를 생산할 수 있으며, 골쇄보의 경우와 같이 항혈전 활성 및 항산화 활성이 동시에 증대된 한약재 생산이 가능함을 제시하고 있다.

구리에 의해 유도된 VBNC 대장균의 특성

구형근 ( Hyung Keun Ku ) , 박상열 ( Sang Ryoul Park ) , 김숙경 ( Sook Kyung Kim )
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VBNC(Viable but nonculturable)란 생존에 불리한 환경하에서 살아 있으나 일반 영양배지에서 자라지 못하는 미생물의 상태를 나타낸다. 본 연구는 구리를 이용해 Escherichia coli에서 VBNC를 유도하고 이의 특성을 살펴보았다. 구리를 처리한 후 전통적인 평판 배양법에 의한 집락 형성계수(colony forming unit, CFU)를 측정한 결과 배양되지는 않으나, Live/Dead BacLight bacterial viability kit 염색 후 유세포계수기로 측정한 결과 살아있는 미생물로 계수되어 VBNC 상태가 확인하였다. VBNC 유도된 미생물로부터 genomic DNA와 RNA를 분리하고 이들의 안정성을 관찰하였는데 DNA에 비해 RNA의 붕괴가 많이 진행되었음을 확인할 수 있었고 RNA의 붕괴는 특정크기로 붕괴되는 것으로 관찰되었다. 또한 생물전용 투과전자현미경(Bio-Transmission Electron Microscope, Bio-TEM)을 통해 VBNC 세포의 형태를 관찰하였는데 VBNC 상태에서는 정상상태에 비해 periplasmic space가 온전하지 못하고 세포내막과 세포 외막이 분리되었으며 세포질의 양이 현저히 감소됨이 관찰되었다.

항효모성 물질 생산을 위한 Rahnella aquatilis AY2000 균주의 생육특성

강민정 ( Min Jung Kang ) , 이복규 ( Bok Kyu Lee ) , 김광현 ( Kwang Hyeon Kim )
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본인 등이 분리한 Rahnella aquatilis AY2000균주는 S. cerevisiae나 C. albicans에 대한 항효모 작용이 있다. 그러나, AY2000균주는 한천이 함유된 고체배지에 배양하면 항효모 작용을 항상 관찰할 수 있었으나, 액체배양에서는 AYS의 활성이 불안정하여, AYS의 생산과 저장 동안에 그 활성이 소실되곤 하였다. 따라서 AY2000균주가 액체배양에서 안정된 AYS를 생산하도록 배지조성의 변화와 배양조건을 검토하기 위해 항효모 활성을 중심으로 실험을 행하였다. 그결과 AY2000균주를 YM배지에 배양시킨 AYS의 MIC는 23.5 ?g/mL이었으나, MYCS배지에 AY2000균주를 배양시킨 AYS의 S. cerevisiae에 대한 MIC는 15.6 ?g/mL였다. 또한 AY2000균주를 MYCS배지를 사용하여 배양온도에 따라 항효모 활성을 측정한 결과 25oC와 MYCS배지의 초기pH를 5.5로 조정하였을 때 MIC는 15.6 ?g/mL로 유지되었으나, 그외에는 항효모 활성이 약화되었다. MYCS배지에서 탄소원으로 포도당이나 설탕을 사용하면 MIC가 15.5 ?g/mL로 다른 탄소원에 비해 항효모 활성이 강하였다. 또한 MYCS배지에 사용된 질소원으로 NH4-citrate는 농도가 증가 될수록 AYS의 항효모 활성이 저하되었으며 오히려 NH4-citrate를 배지에서 제거하는 편이 항효모 활성이 양호하였다. 반면에 금속이온으로 FeCl3를 NH4-citrate가 제외된 MYCS배지에 100 ?M을 첨가하여 AY2000균주를 배양하면 AYS의 S. cerevisiae에 대한 MIC는 7.8 ?g/mL로 강한 항효모 활성을 나타내었다. 또한 AY2000균주는 NH4-citrate가 제거되고 100 ?M FeCl3를 첨가한 MYCS배지(pH 5.5)에서 배양하면 12-24시간 동안에는 MIC가 7.8 ?g/mL을 유지하였으나, 그 후 48-60시간 동안에는 MIC가 31.3 ?g/mL로 항효모 활성이 감소되었다.

Saccharomyces cerevisiae을 이용한 사람의 H-, L-ferritins의 발현 연구

한혜송 ( Hye Song Han ) , 이중림 ( Joong Lim Lee ) , 박시홍 ( Si Hong Park ) , 김재환 ( Jae Hwan Kim ) , 김해영 ( Hae Yeong Kim )
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효모에서 사람의 H-, L-ferritin을 생산하기 위해서, 기존에 복제된 vector를 사용하였으며, 단백질을 발현하기 위해서 각각의 증폭된 ferritin 유전자를 GAL1 promoter에 의해 조절되는 pYES2.1/V5-His-TOPO 효모 발현 vector에 삽입하였다. Western blot 분석을 통해서 사람의 H-, L-ferritin subunits을 함유한 재조합 효모에서 사람의 ferritin이 발현된 것을 확인할 수 있었다. 또한 Atomic absorption spectrometry(AAS) 분석을 통해서 형질변환된 효모의 철 함유량이 대조군과 비교하여 1.6~1.8배 증가한 것을 확인하였다. 향후ferritin이 함유된 형질변환 효모를 사용하여 잠재적으로 철이 강화된 영양성분을 기능성 식품과 사료에 이용할 수 있을 것이다.

고추역병 유발병원균 Phytophthora capsici에 대한 Bacillus sp. AM-651의 항진균활성

이중복 ( Jung Bok Lee ) , 신정학 ( Jeong Hak Shin ) , 장종옥 ( Jong Ok Jang ) , 신기선 ( Kee Sun Shin ) , 최충식 ( Chung Sik Choi ) , 김건우 ( Kun Woo Kim ) , 조민섭 ( Min Sub Jo ) , 전춘표 ( Chun Pyo Jeon ) , 김윤회 ( Yun Hoi Kim ) , 권기석 ( Gi Seok Kwon )
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고추 역병이 발병된 토양 시료에서 길항미생물을 선발 및 개량하여 다시 현장에 적용했을 때 방제능 및 적응력이 높은 생물 방제균을 선발하고자 총 300여점의 경북 북부지역의 토양시료로부터 길항능이 우수한 균주를 분리하였으며, 이들을 대상으로 고추 역병균에 대한 항진균력이 가장 우수한 균주 AM-651을 최종 선발하였다. 분리균주 AM-651은 생리생화학적 특성과 16S rDNA sequencing의 방법을 이용하여 동정한 결과 Bacillus sp.로 동정되었다. 항진균성 활성물질의 생산을 위한 배지의 최적조건은 Davis minimal media를 변형하여 배양하였을 경우 pH 7, 온도 30oC 조건에서 고추 역병균에 대한 항진균 활성이 높았으며, 탄소원으로는 0.5% glucose, 질소원으로는 0.1% (NH4)2SO4, 무기염으로는 0.7% K2HPO4를 첨가 하였을 때 가장 높은 활성을 보였다. 선발된 Bacillus sp. AM-651 균주를 시간대별로 배양 후 항진균력을 측정 해 본 결과 48시간 배양액에서 고추 역병균에 대한 억제율이 가장 높았다. 또한, Bacillus sp. AM-651의 배양액은 pH와 온도의 변화에서 안정된 활성을 보였다. Bacillus sp. AM-651은 고추 역병 외에도 B. sorokiniana, B. cinerea, R. solani 등에 대하여 항진균 활성이 높았고, 다른 식물성 병원균에 대해서도 비교적 항진균 활성이 높게 나타났다. 열처리한 Bacillus sp. AM-651배양 상등액은 처리전과 비슷한 항진균 활성을 가지므로 열에 안정한 물질인 것으로 추측되었다.

유산균 접종에 의한 하수 슬러지의 가용화

양현상 ( Hyun Sang Yang ) , 최정은 ( Jung Eun Lee ) , 이은영 ( Eun Young Lee )
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A new approach to the solubilization of excess activated sludge by the inoculation of lactic acid bacteria was studied to reduce the amount of sludge produced in the activated sludge treatment process. Aerobic microorganism in sludge was lysed in anaerobic condition and the cytoplasmic substance eluted was utilized as a carbon source by lactic acid bacteria. On the basis of sludge solubilization efficiency, Lactobacillus brevis and Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides were selected the best candidates among five kinds of Lactobacillus sp. and seven kinds of Leuconostoc sp. The sludge solubilization efficiency by heterofermentative lactic acid bacteria was more efficient than that of homofermentative bacteria. Initial value of soluble COD (sCOD) was 1050 mg/L at the initial inoculation time increased to 3070 mg/L (192% solubilization) at 96 h of the incubation time. The inoculation of lactobacillus brevis to the sludge resulted in 2824% increase in sCOD value after 96 h of incubation than the control experiment. Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides showed 152% increase of solubilization and 30% increase of S-COD/T-COD on 96 h of incubation time. Considering the increase of S-COD by the inoculation of Leuconostoc sp. on 24 h, 10% inoculation of lactic acid bacteria to the sludge was most effective.
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